1. 包被過程(注意設置空白對照,陰性對照):
將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發,板上應加蓋或將板平放在底部有濕紗布的金屬濕盒中)
2. 封閉酶標反應孔:
5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時將封閉液加滿各反應孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.
洗滌方法:吸干孔內反應液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動,吸干孔內液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數3次
3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):
檢測時一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應采用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量>20μl.
將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.
4. 加入酶標抗體:
酶標抗體: 根據酶結合物提供商提供的參考工作稀釋度進行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結果不穩定.每孔加100μl.洗滌同前。
5. 加入底物液(現用現配):
shou選TMB-過氧化氫尿素溶液,OPD-過氧化氫底物液系統次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.
6. 終止反應:
每孔加入終止液50μl終止反應,于20min內測定實驗結果.
7. 結果判斷:
OPD顯色后采用492nm波長,TMB反應產物檢測需要450nm波長.檢測時一定要首先進行空白孔系統調零.用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(P/N)表示,當P/N大于2時作為抗體的效價.(數值的大小依具體檢測要求而定.)
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