以毛細管轉移方式進行Northern Blotting轉印實驗

 以毛細管轉移方式進行Northern Blotting轉印實驗

要 進行北方雜合反應前，必須先將RNA自洋菜膠體轉移至硝化纖維紙（nitrocellulose membrane） 或尼龍膜 （nylon membrane） 上，這一個過程稱為轉印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛細管轉移法 （capillary transfer）、真空轉移法 （vacuum transfer） 與電轉印法 （electroblotting）。 毛細管轉移法借助吸水紙吸收轉移緩沖液時所產生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉移至膜上；要轉印*，起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費的時間比較長，以其不須要特別的儀器設備，毛細管轉移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA時采用變性聚丙烯酰胺膠體電泳，則必須以電轉印法進行RNA轉印。至于膜的選擇，硝基纖維素膜的優(yōu)點是比較不會產生非專一性反應；不過其一旦 被潤濕再烘干的后，容易碎裂，不適用于進行多次雜合反應。 尼龍膜的優(yōu)點是韌性好，與核酸結合的能力也相當強，正可以彌補硝基纖維素膜的缺點，現已成為主流。 一旦將RNA轉移至膜上后，即可以利用紫外線照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加熱2 h） 將其固定于轉印膜上。

儀器用具：塑料盒；玻璃板；裁紙刀

藥品試劑：20×SSC （3 M NaCl, 300 mM sodium citrate）；尼龍膜；3MM 濾紙；吸水紙；dH2O/DEPC

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方法步驟：

1） 將甲醛洋菜膠體移放在塑料盒內，以dH2O/DEPC沖洗數次，以便去除甲醛。

注意：在移動膠體時請?zhí)貏e留心，不要把膠體弄破了！

2） 注入100 mL 20×SSC，靜置5 min。

3） 根據圖所示，依序在塑料盒上堆棧玻璃板、濾紙 （作為鹽橋）、電泳膠、尼龍膜、三層濾紙、與吸水紙，以便以毛細管轉移方式將RNA 轉印于尼龍膜上；塑料盒內裝入適量20×SSC，以便作為轉移緩沖液。

以毛細管轉移法進行核酸轉印

注意：

a. 濾紙與尼龍膜應先以20×SSC 潤濕，再用于堆棧。

b. 在濾紙、尼龍膜、與電泳膠夾層間可能會有氣泡存在，因此在放好電泳膠、尼龍膜或濾紙后，應立即檢視，并以食指輕輕平移的方式小心趕走氣泡。

c. 此轉印步驟將持續(xù)至隔天才結束。